動(dòng)畫制作『iPS細(xì)胞進(jìn)行角膜再生的臨床移植手術(shù)有望解決供體不足難題』健康知識(shí)mg動(dòng)畫科普

動(dòng)畫制作『iPS細(xì)胞進(jìn)行角膜再生的臨床移植手術(shù)有望解決供體不足難題』健康知識(shí)mg動(dòng)畫科普：

出品：科普中國(guó)

制作：卓思(關(guān)西科健產(chǎn)業(yè)研究院)

監(jiān)制：中國(guó)科學(xué)院計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)信息中心

一直以來，科學(xué)工作者們不斷努力，攻破了臨床醫(yī)學(xué)上的一個(gè)又一個(gè)難題，為以往難以治療的疾病帶來了治愈的希望。近日，全球首例使用iPS細(xì)胞進(jìn)行角膜再生的臨床移植手術(shù)在日本大阪大學(xué)成功進(jìn)行，該研究為角膜疾病患者帶來了新的曙光。

日本國(guó)立動(dòng)物醫(yī)院對(duì)小型動(dòng)物進(jìn)行眼角膜移植前后的對(duì)比照片和染色照片(圖片來源：https://www.cellseed.com/product/img/CellSeed_New_Brochure01.pdf)

供體短缺——角膜移植的“攔路虎”

角膜是眼球前部的透明圓頂狀膜。這個(gè)半毫米厚，一厘米直徑的薄膜，組成了完整的眼外壁，具有強(qiáng)大的聚焦功能，其作用包括透光、折射光和防止異物進(jìn)入等。當(dāng)角膜由于炎癥、外傷或者遺傳疾病等因素變得混濁、不能正確折射光線或者有孔破損時(shí)，視力將嚴(yán)重受損，甚至致殘致盲。角膜病是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病，患者人數(shù)眾多。目前，角膜移植手術(shù)是治療與角膜相關(guān)疾患的有效方法。

人體眼球結(jié)構(gòu)示意圖，作者：Rhcastilhos(圖片來源https://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%A7%92%E8%86%9C)

然而，角膜移植最大的問題便是供體的缺乏。角膜移植需要去除失去功能的角膜，并縫制新的供體角膜。通過角膜移植可以治愈75%的角膜疾病。由于角膜上沒有血管、淋巴，移植后機(jī)體免疫排斥反應(yīng)相對(duì)較低，也不需要血液型配對(duì)。因此，相比技術(shù)而言，供體角膜的短缺是阻礙患者重見光明的主要因素。

現(xiàn)階段，角膜主要供體來自于死者捐獻(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)有400-500萬左右的角膜疾病患者，其中能得到角膜移植的患者不足1萬人，甚至不到患者總?cè)藬?shù)的百分之一。日本每年有2萬只眼睛需要移植角膜，而實(shí)際上能夠進(jìn)行手術(shù)的供體數(shù)量只有1400片。

對(duì)于一些急性角膜疾病患者來說，如果不能在3-5天內(nèi)得到新鮮的角膜，會(huì)導(dǎo)致角膜穿孔感染，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜受損，到最后很可能必須摘除眼球。在中國(guó)，由于供體嚴(yán)重不足，如果不是急性患者一般都要等上1-3年。很多病人因此延誤治療時(shí)機(jī)，造成終生失明的遺憾后果。

豬角膜代替人角膜解決供體問題？免疫排斥來攪局

鑒于角膜移植存在嚴(yán)重的供體短缺問題，科學(xué)工作者始終致力于尋求別的方法和技術(shù)來代替新鮮的人體角膜。

人們首先想到的解決方案是動(dòng)物角膜，最常用的是豬角膜。豬角膜在形態(tài)上與人角膜的相似度可以達(dá)到94%。然而，由于是“異種異體移植”，免疫排斥問題將十分嚴(yán)重。同時(shí)，如何去除豬角膜上攜帶的各種病原菌、寄生蟲等微生物仍然是一個(gè)有待研究的問題。

相比豬角膜移植術(shù)，人工眼角膜作為另一種解決方案無疑獲得了更超前的進(jìn)展。2018年6月，英國(guó)紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)的研究者們用3D打印技術(shù)造出世界首例人工眼角膜。他們用健康人角膜中提取出的干細(xì)胞，混合膠原蛋白和藻酸鹽，僅用10分鐘就得到和患者同樣尺寸和大小的人工眼角膜。盡管該技術(shù)應(yīng)用了人體來源細(xì)胞，有望抑制排異反應(yīng)，但是由于缺乏確實(shí)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，這項(xiàng)新技術(shù)用于臨床研究仍然需花上數(shù)年的時(shí)間。

NEWCASTLE UNIVERSITY(圖片來源 https://www.huffingtonpost.jp/2018/06/03/3d-print-cornea_a_23449897/)

什么是iPS細(xì)胞？

iPS細(xì)胞(induced pluripotent stem cells)，全稱人工多能干細(xì)胞，是將皮膚，血液，尿液等中提取的體細(xì)胞，經(jīng)過多能性誘導(dǎo)因子的導(dǎo)入、培養(yǎng)，所制成的具有分化成人體各種組織臟器并能無限增殖的細(xì)胞。iPS用于臨床最大的優(yōu)勢(shì)即是可以“同種同體移植”，從而最大程度減少免疫排斥。

iPS細(xì)胞由來的角膜如何用于移植？

由iPS由來的角膜細(xì)胞也屬于生物工程類人工眼角膜。就在不久前，日本大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)院的西田幸二教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組宣布他們利用iPS細(xì)胞制成的眼角膜完成了世界首例iPS眼角膜移植手術(shù)。

今年7月，他們將iPS由來的角膜上皮細(xì)胞薄片給患有角膜上皮干細(xì)胞缺乏癥的患者進(jìn)行了移植。這種疾病的致病原理是：富含角膜上皮干細(xì)胞的角膜邊緣部，由于燙傷，酸堿腐蝕，Stevens-Johnson癥候群(一種罕見的皮膚黏膜壞死癥)等原因，角膜上皮干細(xì)胞部分甚至完全缺失。其后果是結(jié)膜上皮侵入角膜內(nèi)，血管等結(jié)膜組織覆蓋在角膜上層導(dǎo)致角膜呈現(xiàn)重度渾濁，引起視力障礙和失明。

移植手術(shù)于今年七月在大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)院成功實(shí)施，患者視力得以恢復(fù)，已于8月23日出院。如果該患者預(yù)后良好，視力得以長(zhǎng)期保持，則年內(nèi)還會(huì)進(jìn)行第二例移植手術(shù)。

西田幸二教授召開關(guān)于首例使用iPS細(xì)胞進(jìn)行角膜移植手術(shù)的記者招待會(huì)(圖片來源：https://www.nikkei.com/article/DGXMZO49163170Z20C19A8000000/)

由iPS細(xì)胞如何得到角膜薄片呢?首先選擇和患者具有同一HLA型(人白血球型抗原，是人體識(shí)別自身和異己的最主要因子，在臟器移植時(shí)HLA匹配度高的患者，移植的成功率也越大)的健康人的iPS細(xì)胞，再將這個(gè)iPS細(xì)胞株，用西田教授小組開發(fā)的SEAM法(self-formed ectodermal autonomous multi-zone自我形成的眼外細(xì)胞的外胚層自主多區(qū)法)進(jìn)行分化，以得到角膜上皮前體細(xì)胞。

角膜上皮細(xì)胞薄片的制作 (圖片來源：Nature 2016. Nat Protoc 2017)

如下圖所示，利用這項(xiàng)技術(shù)，經(jīng)過40天的人工培養(yǎng)，iPS分化成同心圓細(xì)胞層。這個(gè)同心圓細(xì)胞層幾乎完全再現(xiàn)了眼睛的多層結(jié)構(gòu)特征，包括表皮，角膜上皮，晶狀體，神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮層。下圖中第三層外緣就是我們想要的角膜上皮細(xì)胞。之后再將這部分細(xì)胞從中分離出來并加以純化。

由iPS細(xì)胞分化成的四層眼前體細(xì)胞，這些細(xì)胞是胚胎發(fā)育初期，形成眼部結(jié)構(gòu)的初期細(xì)胞，包括表面外胚葉、眼表面外胚葉、晶狀體、眼杯、神經(jīng)外胚葉細(xì)胞。這些細(xì)胞隨著胚胎的發(fā)育會(huì)依次形成構(gòu)成表皮、角膜上皮、晶狀體、視網(wǎng)膜、網(wǎng)膜色素上皮、以及視神經(jīng)等成熟細(xì)胞。(圖片來源：https://www.jst.go.jp/pr/announce/20160310/index.html)

接著，再將分離純化后的角膜上皮前體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，令角膜上皮細(xì)胞自行生成多層結(jié)構(gòu)，當(dāng)達(dá)到一定的厚度時(shí)，即可用于移植手術(shù)。

(圖片來源：https://www.jst.go.jp/pr/announce/20160310/index.html)

除了從iPS細(xì)胞獲得高濃度有活性的角膜上皮細(xì)胞層這個(gè)技術(shù)難關(guān)外，另一個(gè)需要解決的難題是怎樣回收這個(gè)角膜細(xì)胞層。為了從平面培養(yǎng)皿上獲得一個(gè)完整的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)而不破壞生長(zhǎng)中的新鮮細(xì)胞，科研工作者付出了艱辛的勞動(dòng)。

如下圖所示，當(dāng)使用通常的細(xì)胞培養(yǎng)皿和胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞分離時(shí)，細(xì)胞會(huì)被分散成各自獨(dú)立的細(xì)胞。好不容易得到的多層角膜層不能保持完整的結(jié)構(gòu)，當(dāng)然也不能用于移植。因此，科研人員嘗試在普通的培養(yǎng)皿表面涂上對(duì)溫度敏感的化學(xué)聚合物(PIPAAm)，希望僅通過溫度變化就實(shí)現(xiàn)細(xì)胞薄層的分離。當(dāng)溫度在37度時(shí)，這些聚合物和細(xì)胞緊密結(jié)合，當(dāng)溫度從37度降到20度左右時(shí)，這些化學(xué)聚合物發(fā)生變性，和細(xì)胞之間的結(jié)合能力變?nèi)?，由此即可輕松獲得完整的細(xì)胞薄片。

(圖片來源： https://www.funakoshi.co.jp/contents/67935)

iPS細(xì)胞治療眼部疾病已獲豐碩成果

iPS細(xì)胞在眼部疾病上的臨床應(yīng)用，除了這次角膜移植手術(shù)，在2018年日本已經(jīng)實(shí)施了iPS由來的細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜黃斑變性的臨床治療。和這次的方法有所不同的是，由iPS細(xì)胞分化得到的視網(wǎng)膜細(xì)胞當(dāng)時(shí)是以懸浮液的狀態(tài)注射到患者的眼中進(jìn)行的。

這項(xiàng)研究由日本理化學(xué)研究所高橋教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組進(jìn)行，他們?cè)?017年3-9月間，將25萬個(gè)由iPS分化得到的網(wǎng)膜細(xì)胞移植到60-80歲的5位男性眼內(nèi)。之后為期1年的安全性追蹤結(jié)果顯示，移植細(xì)胞沒有在患者體內(nèi)形成腫瘤等嚴(yán)重不良反應(yīng)，5人中有一人有輕微的排斥反應(yīng)，已通過藥物治療得以緩解。5人至今都較好地維持了視力，這也證明了iPS細(xì)胞由來的組織細(xì)胞在再生治療上的安全性。我們期待iPS由來的角膜薄片，也能安全穩(wěn)定地在患者身上持續(xù)發(fā)揮作用。

自山中伸彌教授發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞以來，日本就將iPS在再生醫(yī)療方面的應(yīng)用列為國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展領(lǐng)域。目前在日本，不僅僅是醫(yī)學(xué)界，生物界，材料工學(xué)界，甚至各大藥企都聯(lián)合起來，全力推動(dòng)iPS的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。借助產(chǎn)學(xué)研的通力合作，如果可以實(shí)現(xiàn)iPS角膜薄片的工業(yè)化生產(chǎn)，角膜供體不足的問題將會(huì)得到根本性地解決，會(huì)有更多的角膜疾病患者得以重見光明。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ryuhei Hayashi & Kohji Nishida et al.Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature volume531, pages376–380 (17 March 2016)

[2]3D打印機(jī)制作眼角膜

https://idarts.co.jp/3dp/famu-3d-printing-cornea-technology/

[3] Hayashi R et. al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells 2017 Nature Protocols

[4] Cell sheet engineering, Masayuki Yamato,Teruo Okanoa.MaterialsToday,Volume 7, Issue 5, May 2004, Pages 42-47

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